一、細(xì)胞處理

接下來，我們會(huì)從細(xì)胞的來源，如何培養(yǎng)，以及使用的培養(yǎng)基等幾個(gè)方面詳細(xì)的給大家介紹一下細(xì)胞樣本是如何處理的。

1. ELISpot 和 FluoroSpot適用于多種細(xì)胞類型

細(xì)胞可以來源于各種來源以及不同的物種。比如培養(yǎng)的細(xì)胞系、人的全血或小鼠的脾臟。來自于粘膜組織的細(xì)胞也能應(yīng)用于ELISpot。同時(shí)來源于不同物種的靜脈血和脾臟細(xì)胞也可用于ELISpot，例如猴子、小鼠、大鼠、牛、馬、羊、豬等。

2. 較常用的細(xì)胞--外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）

我們可以很容易地通過密度梯度離心法從血液中獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞（Peripheral blood mononuclear cells, PBMC）。提取出來的PBMC可以直接使用，也可以被凍存，用于以后的ELISpot/FluoroSpot實(shí)驗(yàn)。對于人來源的PBMC樣本，血液樣本中應(yīng)該加入檸檬酸鈉抗凝或者直接使用肝素抗凝管收集。

3. 細(xì)胞的質(zhì)量是影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果至關(guān)重要的因素

在活細(xì)胞中，細(xì)胞凋亡的比例都不高，能夠正常的分泌蛋白質(zhì)，不會(huì)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。細(xì)胞處理過程的標(biāo)準(zhǔn)化對于成功的細(xì)胞檢測是至關(guān)重要的，特別是對于ELISPOT/FLUOROSPOT實(shí)驗(yàn)。從血液樣本中提取出來的PBMC，超過3小時(shí)就可能被活化的粒細(xì)胞污染，進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

解決這一問題的三種方法：

①在保存過程中輕輕攪拌血液樣品；

②在保存樣本前，用PBS或RPMI1:1稀釋血液樣本；

③在檢測前去除血液樣本中的粒細(xì)胞。

4. 實(shí)驗(yàn)中可以使用凍存的細(xì)胞

在 ELISPOT 檢測的應(yīng)用中，往往需要用到凍存的淋巴細(xì)胞樣品作為檢測細(xì)胞。由于 ELISPOT檢測的是細(xì)胞的免疫功能，不僅僅需要保持細(xì)胞的存活率，而且還要保證細(xì)胞的功能不發(fā)生變化。傳統(tǒng)的細(xì)胞凍存方法通常是為了保存細(xì)胞株，對細(xì)胞存活率的要求不高，更沒考慮保持細(xì)胞原有的免疫狀態(tài)，所以傳統(tǒng)的細(xì)胞凍存方法已經(jīng)不能滿足 ELISPOT 檢測的要求。

5. 細(xì)胞復(fù)蘇

細(xì)胞凍存和復(fù)蘇都會(huì)導(dǎo)致不同數(shù)量的細(xì)胞死亡，這在我們復(fù)蘇后并不能馬上觀察到。我們建議復(fù)蘇后的細(xì)胞在37°C新鮮的培養(yǎng)基中放置1小時(shí)或更長時(shí)間。 這樣細(xì)胞碎片就可以很容易地被去除，并提高了檢測性能。

二、ELISpot和FluoroSpot的血清和培養(yǎng)基

細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境能夠影響我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中培養(yǎng)基起著至關(guān)重要的作用。請考慮以下方面，以產(chǎn)生高效的細(xì)胞培養(yǎng)物。

1. 培養(yǎng)基

用于ELISpot和FluoroSpot的細(xì)胞培養(yǎng)基應(yīng)與待測細(xì)胞相容。 RPMI培養(yǎng)基常與血清一起使用。如果在細(xì)胞培養(yǎng)過程中CO2受到限制，可以加入HEPES以維持細(xì)胞培養(yǎng)的pH值。通常推薦使用青霉素和鏈霉素等抗生素來降低污染的風(fēng)險(xiǎn)。

2. 血清

我們應(yīng)選擇一些既可以支持細(xì)胞培養(yǎng)，同時(shí)背景值又比較低的一些血清。并且血清本身不應(yīng)引起非特異性的細(xì)胞活化或蛋白分泌。我們建議使用胎牛血清。血清批次間可能會(huì)有所不同，在ELISpot和FluoroSpot實(shí)驗(yàn)前我們最好測試一下新的批次。我們一般推薦血清熱滅活。不推薦人血清，因?yàn)樗赡芎心芨蓴_檢測的異嗜性抗體或固有分析物。

3. 無血清培養(yǎng)基---消除血清中不確定成份的影響

 含替代血清成分從而提高細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性：

▲維持淋巴細(xì)胞存活，保持細(xì)胞活力和免疫功能狀態(tài)

▲不會(huì)額外刺激陰性細(xì)胞產(chǎn)生額外產(chǎn)生任何一種細(xì)胞因子

▲不會(huì)抑制陽性細(xì)胞分泌各種因子

產(chǎn)品優(yōu)勢：

▲成分固定，徹底消除了批次間的差異。

▲不含雜蛋白，背景更弱，斑點(diǎn)更清晰。

▲不含抑制細(xì)胞因子分泌成分，斑點(diǎn)更多，更加反映真實(shí)的結(jié)果。

三、細(xì)胞稀釋指南

1. 活細(xì)胞計(jì)數(shù)

用臺盼藍(lán)或細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測活細(xì)胞的數(shù)量。評估凋亡細(xì)胞的數(shù)量是一個(gè)優(yōu)勢。

2. 計(jì)算需要的細(xì)胞數(shù)

計(jì)算所需的細(xì)胞數(shù)量和所需的體積。建議制備過量的細(xì)胞懸浮液（10-20%），以確保有足夠的體積用于實(shí)驗(yàn)。

3. 加入適量的培養(yǎng)基

將培養(yǎng)基加入到細(xì)胞懸浮液中。用于T細(xì)胞檢測的細(xì)胞濃度通常在0.5×106/ml和3×106/ml之間。

4. 混勻

充分混勻細(xì)胞懸液。

5. 將細(xì)胞懸浮液移到孔板中

在向孔板中加入細(xì)胞之前，應(yīng)該先添加刺激物。另一種方法是將細(xì)胞和刺激物充分混勻后再加到孔板中。將細(xì)胞懸浮液移到孔板中。如果同時(shí)操作一個(gè)以上的孔板，應(yīng)在加入細(xì)胞懸液前在重新混勻一下細(xì)胞懸液。一個(gè)孔板大約需要12ml。

建議稀釋的步驟:

四、細(xì)胞孵育

1. 細(xì)胞數(shù)

每個(gè)孔中細(xì)胞的數(shù)量必須與細(xì)胞類型和細(xì)胞分泌的頻率相適應(yīng)。如果頻率非常低，例如在10000個(gè)細(xì)胞中有1個(gè)，那么我們就需要更多數(shù)量的細(xì)胞，通常有250000個(gè)細(xì)胞/孔。當(dāng)頻率較高時(shí)，例如在10個(gè)細(xì)胞中就有1個(gè)，那么我們僅需要大約5000個(gè)細(xì)胞/孔就足夠了。

2. 測定細(xì)胞線性度

在分析中，如果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞沒有成線性關(guān)系，可能是由于細(xì)胞數(shù)量不夠，或者細(xì)胞刺激不夠造成的。比如當(dāng)分析抗原特異性T細(xì)胞時(shí)，PBMC細(xì)胞數(shù)不應(yīng)低于每孔200000個(gè)細(xì)胞。

3. 激活

在加入細(xì)胞之前，應(yīng)將刺激物添加到孔板中，或者刺激物與細(xì)胞混勻后一起加入到孔板中。細(xì)胞被添加到孔板中后就不能再添加更多的培養(yǎng)基，因?yàn)楹蠹尤氲呐囵B(yǎng)基會(huì)使細(xì)胞向邊緣周圍擴(kuò)散。在ELISPOT/FLUPOSBOT讀板前，應(yīng)清洗細(xì)胞以避免膜的背景染色。在B細(xì)胞ELISPOT實(shí)驗(yàn)中洗板是很重要的。

4. 動(dòng)力學(xué)

在建立適合細(xì)胞孵育時(shí)間時(shí)，應(yīng)考慮蛋白質(zhì)分泌的動(dòng)力學(xué)因素。某些分析物僅在刺激超過24小時(shí)后才會(huì)分泌。

5. 濕度

我們要確保足夠的濕度來培養(yǎng)細(xì)胞。建議培養(yǎng)過程中用錫箔紙包裹孔板，避免蒸發(fā)。一般的建議，37°C ，5% CO2孵育細(xì)胞。

6. 靜置

避免細(xì)胞在培養(yǎng)過程中突然移動(dòng)，因?yàn)檫@將對斑點(diǎn)的形成產(chǎn)生不利的影響。

前三期詳情請參考：

ELISpot Part 1——ELISpot原理、優(yōu)勢及品牌推薦

ELISPOT Part 2-T細(xì)胞、B細(xì)胞ELISPOT介紹以及Mabtech相關(guān)產(chǎn)品

ELISpot Part 3——ELISpot的對照設(shè)置及不同的刺激物簡介