1. 細胞凍存復蘇技術簡介

在ELISPOT檢測的應用中，往往需要用到凍存的淋巴細胞樣品作為檢測細胞。由于ELISPOT檢測的是細胞的免疫功能，不僅僅需要保持細胞的存活率，而且還要保證細胞的功能不發生變化。傳統的細胞凍存方法通常是為了保存細胞株，對細胞存活率的要求不高，更沒考慮保持細胞原有的免疫狀態，所以傳統的細胞凍存方法已經不能滿足ELISPOT檢測的要求。參見圖7.1。

考慮到ELISPOT檢測的特殊性，荷蘭U-CyTech公司經過精心的研究與反復的驗證，推出了Cryostar?凍存試劑盒，在凍存液中添加了一系列對細胞有特殊保護作用的保護劑。達科為公司在接到Cryostar?凍存試劑盒之后，在我們的實驗室以及國內數家客戶的實驗室做了細胞凍存與復蘇的實驗，并且對復蘇之后的細胞做了ELISPOT檢測。結果表明，淋巴細胞的存活率超過90%，ELISPOT斑點形成頻率與新鮮細胞完全相同。參見圖6.1。

2005年底，在達科為公司與中國生物制品檢定所合作制備凍存的質控細胞庫時，Cryostar?2005年底，在達科為公司與中國生物制品檢定所合作制備凍存的質控細胞庫時，Cryostar?凍存試劑盒與本文的凍存復蘇技術經受住了嚴格的考驗，細胞存活率達到95%。這表明，該項技術已經完全成熟，可以用于建立大型凍存細胞庫（108-109cells）。

凍存試劑盒與本文的凍存復蘇技術經受住了嚴格的考驗，細胞存活率達到95%。這表明，該項技術已經完全成熟，可以用于建立大型凍存細胞庫（108-109cells）。

根據我們的實驗經驗，完美的細胞凍存效果需要優質的凍存試劑盒加上嚴格規范的實驗操作。二者缺一不可，不可偏頗，千萬不要因為有了好的試劑盒而放松對實驗操作的要求。為了幫助國內的客戶解決好細胞凍存的問題，達科為公司以Cryostar? 凍存試劑盒使用說明為例特此編撰這份詳細的細胞凍存、復蘇實驗操作手冊，僅供參考。

Cryostar?凍存試劑盒（貨號UH-F1002-050）的內容如下：

    2 Cryostar? 重懸液(Cryostar? Resuspension Medium)，1瓶，液體，25ml。-20 °C長期保存，一旦開始使用，放置于4°C冰箱。

    2 Cryostar? 2×凍存液(Cryostar? 2× Freezing Medium)，1瓶，液體，25ml，-20 °C長期保存，一旦開始使用，放置于4°C冰箱。

    2 英文原裝操作手冊一本；中文詳細操作手冊一本。

2. 細胞凍存、復蘇的標準程序

l 實驗儀器：

    2 可控溫度細胞離心機離心機；

    2 血球計數板或者自動細胞計數設備； 

    2 細胞程序降溫盒Nalgene “Mr. Frosty”；

    2 -70°C冰箱；

    2 液氮罐；

    2 37°C水浴鍋。

l 耗材準備

    2 15ml圓錐底聚丙烯（PP）離心管； 

    2 無菌的細胞凍存管，2ml，外螺旋；

l 試劑配制

    2 熱失活補體胎牛血清； 

    2 R0培養基：RPMI-1640培養基，含谷氨酰胺，加入1%雙抗，不加血清。

    2 達優?無血清培養基：已經含有谷氨酰胺和雙抗，打開即用。

    2 Cryostar?重懸液(Cryostar? Resuspension Medium)：含有細胞凍存保護成分，-20°C長期保存，4°C可以保存6個月。

    2 Cryostar? 2×凍存液（Cryostar? Freezing Medium）：含有細胞凍存保護成分以及DMSO，-20°C長期保存，4°C可以保存6個月。

    2 臺盼藍

l 細胞凍存程序

1. 將備用細胞凍存管做上詳細記號。細胞凍存管、細胞凍存盒、Cryostar? 重懸液、Cryostar? 2×凍存液放入4 oC熱平衡。

2. 對要凍存細胞進行計數，然后4 oC，400g離心10 min。

3. （冰上操作）棄上清，根據細胞計數結果加入4 oC的Cryostar? 重懸液重懸，使細胞濃度調整到兩倍的凍存濃度（比如想要凍存的細胞濃度為：1×107 cells/ml，就用重懸液將細胞濃度調整到2×107/ml），然后將細胞吹打均勻。

注意：重懸液不含有DMSO，所以這一步動作可以稍微劇烈。

4. （冰上操作）然后逐滴加入等體積冰浴的Cryostar? 2×凍存液，（細胞濃度變為1×107 cells/ml）。

注意：一定要逐滴加入，避免溶液中DMSO濃度的劇烈變化，詳見后面的說明。

5. （冰上操作）以每只1ml細胞懸液的量分裝入在-20oC熱平衡過的凍存管，然后將凍存管的蓋子擰嚴實。否則液氮會滲漏進來。

6. 立即將凍存管放入已在4oC熱平衡的凍存盒(“Mr. Frosty”)，然后將凍存盒放入-70oC冰箱內。也可以將凍存管放于程序降溫儀中，以1oC/min的速率降溫到–70oC。

7. 24hr后，把-70oC保存的凍存管轉移到液氮中。

8. 將細胞在液氮罐中凍存位置記錄在實驗室的液氮設備管理單上。

l 細胞復蘇程序

1.血清、R0培養基需要在4oC熱平衡，Lympho-Spot?無血清培養基需要37oC熱平衡。15ml離心管需要4oC熱平衡。水浴鍋要預先調到37oC。

2.用夾子將細胞凍存管從液氮中取出。如果有液氮滲漏到凍存管中，要稍微擰開管蓋，讓氣化的液氮逃逸。

警告：據報道，有些凍存管在解凍時會發生爆炸，為了消除這種危險，建議實驗中只使用牢固的聚乙烯凍存管用于液氮保存。

3.用夾子持住凍存管，浸入37oC水浴鍋內。輕輕晃動凍存管，注意管內凍存細胞的融化情況。當管內的冰核還有黃豆大小的時候，取出來，轉移到超凈工作臺內。用酒精棉擦拭管口，然后將凍存管插于碎冰之上。

注意：這一步對細胞存活率至關重要。既要盡快融化，以減少融化過程對細胞的損害；又要盡可能減少細胞在較高溫度停留的時間，以減少DMSO對細胞的毒害。切不可將凍存管放在在燒杯內不管。

4.（冰上操作）用移液槍取1ml胎牛血清(4oC)，槍頭插到凍存管管底，緩慢地加入這一毫升血清。

5.（冰上操作）溫柔地將凍存管內的細胞懸液吸取出來，轉移到一個預冷的15ml離心管內。然后，用移液槍取1mlR0培養基(4oC)，槍頭插到離心管管底，緩慢地加入這一毫升培養基。然后換槍頭再重復兩次，一共向離心管管底加入3ml的R0培養基。

6. 蓋上離心管管蓋，輕輕上下顛倒混勻。然后緩慢的補加R0培養基到14ml，此時不再需要從管底加入了。補加滿，然后蓋上管蓋，輕輕的上下顛倒混勻。

7. 4oC，400g離心10min，棄上清，加入1ml Lympho-Spot?無血清培養基，混合均勻。

8.（優化步驟，可以略過）如果細胞有成團現象，這是由于死亡細胞釋放出來的DNA纏繞所致。可以加入0.1ml DNase(1mg/ml)，37 oC孵育10min。

9. 取20μl細胞懸液，臺盼藍活細胞計數，計算存活率（viability）。

       根據計數結果，補加Lympho-Spot?無血清培養基至所需要的細胞濃度，進行ELISPOT檢測。